在道尔顿的早期论文中，他关注的是空气压强与空气饱和水蒸气浓度的关系。与当时的解释截然不同,他认为空气是由多种气体组成的混合物，而不是像水一样的化合物。在实验中，道尔顿观察到纯氧气负载的水蒸气量不如纯氮气,他凭着直觉,天才般地提出这是由于氧原子比氮原子个头更大、质量更重造成的。"为什么不同气体对水蒸气的负载量不同呢?”他思索着，"这个问题反复在我脑海里盘旋，虽然现在证据还不够充足,但我几乎已经可以确定主要是各种气体中基本微粒的质量和数量的不同在起着决定性的作用。”
在一篇于1803年10月21日发表在曼彻斯特学会会刊的论文中，道尔顿在原子理论方面又有了突破性的进展，“据我所知，研究基本微粒的相对质量是一个新课题。最近我一直在钻研这个问题并获得了一些成绩。接着,道尔顿阐述了获得不同元素气体的基本粒子质量的过程,也就是计算原子量的方法。他还表示,每种元素的原子在结合成化合物时往往遵循极简单的比例关系,因此可以在已知化合物中元素质量的条件下计算得到未知原子的质量，这种方法被后世称为“定比定律”。
道尔顿的原子理论可以概括为：
（1）原子在一切化学变化中是不可再分的最小单位。
（2）同种元素的原子性质和质量都相同，不同元素原子的性质和质量各不相同，原子质量是元素基本特征之一。
（3）推导并用实验证明了不同元素化合时遵循倍比定律。
道尔顿的原子理论是在有关化学反应的两条实验规律的基础上总结推理而来。一是化学反应前后反应体系的总质量不变，也即质量守恒定律。二是无论一种反应物的量有多少，反应前后组成它的各种元素的质量的比例总是保持不变，即定比定律。
道尔顿原子理论，是人类第一次依据科学实验的证据，成系统的阐述了微观物质世界，是人类对认识物质世界的一次深刻的，具有飞跃性的成就，标志着近代化学发展的开始。因为化学作为一门重要的自然科学，它所要说明的现象本质正是原子的化合与化分。道尔顿的学说已抓住了这一核心和本质，主张用原子的化合与化分来说明各种化学现象和化学定律间的内在联系。
1811年，阿莫迪欧·阿伏伽德罗从原理上对于道尔顿的理论进行了修正。阿伏伽德罗提出分子是决定物质性质的最小微元，分子是由原子构成的。阿伏伽德罗所做出的修正划清了分子和原子概念间的区别，并与道尔顿的原子理论形成了解释物质微观构成的原子-分子学说。
然而，当时的部分科学家却极力贬低道尔顿的伟大功绩，指出他的原子论是基于前人的基础才提出的。不管怎么说，正是道尔顿在实验（包括他自己发现的“定比定律”）的基础上对已有的观点加以整理、分析、归纳，使原子学说脱离了思辨的范畴，才建立了这门主流学科。